非洲猪瘟疫苗的反向疫苗学设计尝试

利用反向疫苗学设计非洲猪瘟疫苗的尝试

AlbertRos-Lucas ¹，FlorenciaCorrea-Fiz ^2,3 ,Laia Bosch-Camós ^2,3, Fernando Rodriguez^2,3,* andJulio Alonso-Padilla ¹

[1.巴塞罗那全球健康研究所(ISGlobal)；2.西班牙动物健康研究中心；3.欧洲新发和再发猪病研究与控制合作中心]

摘要：非洲猪瘟病毒是导致猪发生非洲猪瘟的病原体，而非洲猪瘟是一种可传播、严重的出血性疾病，会造成养猪业巨大的经济损失。针对非洲猪瘟的防控，目前既没有治疗方法，也没有疫苗，控制其传播的唯一方法是大量扑杀猪群。到目前为止，经典的疫苗开发方法在安全性和有效性方面都没有取得理想的结果。如今，由于基因组学和蛋白质组学技术的进步，可以探索反向疫苗学策略来设计替代疫苗的配方。在本研究中，我们使用基于公开可用的免疫形式学工具的内部流程，分析了非洲猪瘟病毒蛋白序列，以确定未来疫苗组合所关注的抗原表位。这些包括来自免疫抗原表位数据库的实验验证的序列，以及重新预测的序列。实验验证的和预测的抗原表位按照一系列标准进行优先排序，这些标准包括进化保护性、存在于毒性和目前流通的非洲猪瘟病毒格鲁吉2007/1分离株中，以及与猪的蛋白质组或来自猪肠道微生物群的假定蛋白质缺乏一致性。根据这一策略，选择了29个B细胞、14个CD4⁺T细胞和6个CD8⁺T细胞抗原表位，这意味着是一个研究基于非洲猪瘟病毒抗原表位的疫苗的保护能力的起点。

关键词：非洲猪瘟病毒；猪；B细胞；CD4+T细胞；CD8+T细胞；抗原表位；疫苗组合

1 绪论

非洲猪瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV)是引发非洲猪瘟(Africanswinefever，ASF)的病原体，是全球感染家猪(野猪)的最致命的病原体之一。20世纪20年代，在肯尼亚引进欧洲家猪后，该病首次被发现；在20世纪上半叶，该病的暴发主要局限在撒哈拉以南非洲的东部和南部的猪群中。从那时起，非洲猪瘟病毒已经蔓延到全球各地，不仅在其他非洲国家，而且在欧洲、加勒比海、南美洲、大洋洲和亚洲的猪群中转化成流行病。最近一次从非洲传入欧洲的非洲猪瘟病毒引发了有史以来最大的非洲猪瘟疫情，成为当今全球养猪业的头号威胁。由于其潜在的破坏性影响，非洲猪瘟被列为必须向世界动物卫生组织(OIE)通报的疾病。

在非洲，非洲猪瘟病毒的储库主要是非洲野猪，如疣猪(Phacochoerusafricanus)和布什猪(Potamochoeruslarvatus)，在这些猪感染后发生无临床症状。在这些地区，维持非洲猪瘟病毒的感染周期离不开钝缘蜱(Ornithodoros)属的蜱虫这类虫媒载体，它们负责向家猪传播病毒。如今，直接接触受感染的材料已经成为非洲猪瘟病毒在欧洲和亚洲的猪群中传播的主要风险因素，如死猪的尸体或猪肉制品，以及通过与受感染的个人的接触传播。欧亚大陆的野猪也容易感染非洲猪瘟，感染后表现出与家猪相似的临床症状和死亡率，影响了欧亚大陆防控非洲猪瘟的努力效果。非洲猪瘟病毒可引起感染猪出现急性的出血性高烧，毒性最强的变种几乎可使感染猪100％的致命。目前，对非洲猪瘟的防控还没有疫苗或治疗方法，控制病毒传播的唯一有效方法是扑杀受影响地区的所有猪，即受感染的猪和可能与之接触过的猪。需要安全地处理死猪的尸体和其他被污染的材料，这包括实施最大限度的控制和生物安全措施，以及限制猪及其衍生产品的流动。

非洲猪瘟病毒是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)家族的唯一成员，是属于核细胞质大DNA病毒(nucleocytoplasmiclarge DNA viruses，NCLDVs)组的一种大病毒(约200nm)。非洲猪瘟病毒有一个复杂的多层结构，由几个脂质和蛋白质层组成(图1)，基因组被第一层蛋白层包裹着，该层由核心壳内衣壳组成，而核心壳内衣壳又被内部脂质双层包膜覆盖，其本身包含在一个二十面体蛋白质衣壳中。最后，细胞外颗粒通过质膜排出时获得脂质外膜。非洲猪瘟病毒的主要目标细胞是巨噬细胞，但也能感染树突状细胞和其他单核细胞。病毒基因组由长度在170Kbp～193Kbp的单双链DNA分子组成，可编码超过150个开放阅读框(ORF)，包括其自身的复制机制、基因调控、宿主防御规避因子以及其整套结构蛋白。不同毒株在基因组长度和ORF数量上存在较大的差异，这可归因于位于基因组两端可变区域的多基因家族(multigenefamily，MGF)具有数量不同的基因，而在中央保守区域的基因中可以发现更细微的差异。值得注意的是，人类对相当多的病毒蛋白仍不知它们的功能。

图1 病毒颗粒形态示意图

注：非洲猪瘟病毒(Africanswine fevervirus，ASFV)蛋白的定位，其中B细胞抗原表位是根据序列化方法预测得知的。括号内的字符为开放阅读框架(openreading frames，ORFs)的名称(在适用时)；大括号内的数值为预测抗原表位的数量。

扫二维码或长按，参加4月18日晚8时，线上杜洛克种猪拍卖活动

多种来自不同国家、不同发病地、具有不同毒力水平的非洲猪瘟病毒毒株已得到确认。ASFV的第一个完整的基因组测序来自20世纪70年代初巴达霍斯(西班牙)的分离株，该分离株适合在Vero细胞(Ba71V)中生长。自那时之后，已完成了其他许多基因组的测序，截至2020年8月，在通用蛋白质数据库(universalproteinresource，UniProt)中获得了来自不同病毒变体或分离株的46个蛋白质组。这些基因组可分为22种不同的基因型，它们是根据主要的衣壳蛋白p72基因(B646L)的3’端序列分析确定的。从地理上看，在非洲，非洲猪瘟病毒基因型变异最大，而在欧洲、美洲和亚洲，人们只发现了基因型I和基因型II的分离株。到目前为止，还没有证据表明病毒的基因型与其毒力有关。

感染后存活的猪会产生免疫力，接种减毒病毒会诱发动物机体产生免疫反应和变异株特异性保护。因此，尽管安全问题阻碍了减毒活疫苗的田间应用，但仍可以采取疫苗接种策略进行一定程度的预防。其他免疫方法，如蛋白质亚单位或DNA构建体，虽然其中一些能诱发特异性免疫反应，但无法达到减毒活病毒所能达到的保护水平。尽管如此，现有的少数体内保护数据表明，已经可以确定，无论接种减毒活病毒还是亚单位疫苗，分子和免疫学机制参与了这种保护。一方面，人们普遍认为特异性T细胞发挥了关键作用，不过引发保护性反应的特异性T细胞决定因素在很大程度上仍然是未知的。另一方面，已经发现了几种非洲猪瘟病毒血清学决定因素，但它们的保护作用还不清楚。然而，据报道，非洲猪瘟病毒特异性抗体的被动转移可提供免疫保护，证明其在控制感染上能够发挥一定的作用。此外，新的证据表明，微生物群可能在防御病毒方面起着重要的作用，因为将疣猪的粪便移植到家猪身上，可以实现对非洲猪瘟病毒的部分免疫保护。

一种针对多种抗原的替代性疫苗设计策略，能够在不影响安全性的情况下诱发动物机体产生保护性免疫反应，这可能是解决病毒生物学复杂性的一种方法。在这方面，反向疫苗学(reversevaccinology，RV)的应用，对筛选越来越多的非洲猪瘟病毒序列以寻找最佳目标抗原表位非常有帮助。为开发难以分离和培养的病原体的疫苗，反向疫苗学是基于对病原体基因组和/或蛋白质组数据的计算分析，以确定对假设的疫苗最感兴趣的蛋白质。使用生物信息学(in-silioapproach)方法还可以考虑病毒的变异性，特别是确定不变区域，有助于设计出具有广泛免疫保护性的疫苗。同样，它可以避免诱导保护性免疫反应所不需要的序列或可能会导致疾病恶化的序列。令人鼓舞的是，已经有一种由反向疫苗学产生的针对脑膜炎奈瑟菌血清B群的疫苗在2013年获得批准。

2 结果

2.1 非洲猪瘟病毒蛋白质空间的分析

从通用蛋白质数据库(UniProt)中的46个病毒蛋白质组中共下载了7088条非洲猪瘟病毒蛋白质序列(补充表S1)。总共有7个蛋白质组由于其蛋白质的数量异常而被放弃了：Kyev2016(UP000321214)、波兰2016o23(UP000274966)、波兰2016o9(UP000268777)、波兰2017C220(UP000282187)、波兰2016o10(UP000278405)、SardiniaSassari 2008(UP000266411)和南非1985/SPEC57(UP000423628)。

用CD-HIT进行蛋白质聚类产生了459个聚类。为了考虑每个聚类中的非洲猪瘟病毒的变异性，我们过滤掉了序列源自少于14个不同蛋白质组的聚类。考虑到这是来自基因型Ⅱ(非洲猪瘟格鲁吉2007/1分离株)的可用非洲猪瘟病毒蛋白质组的数量，我们选择了这个阈值，以试图保留所有可能的属于该基因型的开放阅读框。因此，我们考虑进一步分析包括来自14个或更多个不同非洲猪瘟病毒蛋白质组的蛋白质的173个簇。值得注意的是，为量化位置的变异性而计算香农信息熵(shannonentropy)值显示，在集群的多序列排列(multiplesequenceAlignments，MSA)中，82.5％的氨基酸位置是完全不变的，即平均信息量熵值H=0(数据未显示)。因此，为了尽可能的严格，所有的后续分析都是用指定香农熵阈值为H=0的不变的共识蛋白质组(consensusproteome)来完成的。

2.2 鉴定非洲猪瘟病毒假定暴露蛋白质(putative-exposedproteins)

到目前为止，在非洲猪瘟病毒的表面只确定了一种蛋白质：CD2同系物(ORF：E402R)。我们付出了更多的努力，目的是识别有可能出现在受感染细胞的膜的外部表面和/或胞外病毒颗粒上的病毒蛋白，因此容易被抗体中和。为了确定假定暴露的蛋白质，我们用亚细胞定位预测工具测定非洲猪瘟格鲁吉2007/1分离株蛋白质组(UP000141072)，根据注释规范(criteriaofannotation)以及预测的信号肽序列和/或至少一个跨膜结构域的存在，共选择了49个假定暴露蛋白质。假定暴露蛋白质包括那些被预测为暴露的蛋白质，以及那些以前被描述为形成一部分外衣壳的蛋白质，在无包膜的感染性颗粒的情况下是抗体的潜在目标(见补充表S2)。所有这些都被标记为“暴露”，并与非洲猪瘟病毒蛋白质组的其他部分聚类，以找到所有非洲猪瘟病毒“暴露”蛋白质的同系物。在包括14个或更多个非洲猪瘟病毒蛋白质组的173个聚类中，只有43个有“暴露”蛋白质，并被选中用于进一步探索B细胞抗原表位的存在。

2.3 B细胞抗原表位的选择

我们在免疫抗原表位数据库(ImmuneEpitopeDatabase，IEDB)中发现了该病毒102个实验验证的、独特的抗原表位，其中76个是B细胞抗原表位。我们保留了那些源自假定暴露蛋白的抗原表位，然后对照非洲猪瘟病毒不变的“暴露”蛋白组解析了它们的全序列。结果发现了9个保守的B细胞抗原表位。为了进一步组织和管理这一选择，我们使用基于局部序列比对检索工具(basiclocal alignment searchtool，BLASTP)将这些序列与野猪的及其微生物群中的蛋白质组进行比较。我们放弃了那些与野猪的蛋白质或其微生物群中的蛋白相似度大于70％的序列，将名单减少到来自三个不同蛋白的四个保守的B细胞抗原表位：两个来自主要的衣壳蛋白p72(B646L)，两个来自内衣壳蛋白p22(KP177R)和p54(E183L)(表1)。结果发现，抗原表位VCKVDKDCGSGEHCV(p22蛋白)和FPENSHNIQTAGKQD(p72蛋白)与序列化预测抗原表位共享残基；后者也与结构化预测抗原表位共享残基。

2.4  重新(denovo)预测的B细胞抗原表位

除了免疫抗原表位数据库(IEDB)中传统的B细胞抗原表位外，我们还采用了两种方法来预测新的抗原表位：序列化方法和结构化方法。按照序列化方法，我们检索了42个在非洲猪瘟病毒中保守的潜在B细胞抗原表位的列表。对于那些来自我们预测的跨膜结构区的蛋白质抗原表位，我们对它们进行了勘测，以评估它们的定位是否在“外面”。任何勘测到跨膜蛋白内侧或跨膜部位的抗原表位都被丢弃。此外，我们用PyMOL对主要的衣壳蛋白p72(PDBID：6L2T)的潜在抗原表位进行了可视化，并丢弃了那些没有暴露的抗原表位，即朝向病毒颗粒外罩的抗原表位。通过这种方法，我们将列表中的抗原表位减少到29个，并取消了另外两个抗原表位，因为它们与野猪或其粪便中微生物群的蛋白质序列的一致性＞70％。所选择的27个预测的B细胞抗原表位来自于13个不同的蛋白质(表2)。其中一些抗原表位与在IEDB中验证的序列共享残基，但不一定归入表1中。这是由于IEDB中的抗原表位是根据共识蛋白质组进行整体解析的，这就导致放弃了具有可变位置的长序列和/或与猪体内蛋白质的一致性大于70％的序列。

对于结构化方法，我们对蛋白质数据库(proteindata bank，PDB)中提供的非洲猪瘟病毒主要衣壳蛋白p72的两个结构上残基的灵活性和相对可溶性(relativesolventaccessibility，RSA)施加了特定的约束：6KU9和6L2T。我们确定了13个潜在的抗原表位，这些抗原表位在“暴露”的不变蛋白质组中也是保守的。在放弃非独特的肽后，由于p72同源三聚体组装成胶囊体，并融合了重叠的抗原表位，我们最终得到了8个独特的结构预测的B细胞抗原表位，其中仅有3个与野猪的及其微生物群的蛋白质的一致性≤70％，均来自PDB结构6L2T。在PyMOL中观察它们的易接近性时，我们放弃了位于该蛋白质底部的一个抗原表位，因此是非暴露的。其余两个潜在的抗原表位显示在表3和图2中。这两个抗原表位也是用序列化方法预测获得的(表2)。

注：抗原表位KPHQSKPILTDENDTQRT(黄色)和NIQTAGKQDITPITD(蓝色)被映射到PDBref.6L2T。

(A)侧视图。(B)俯视图。

图2 在主要衣壳蛋白p72中根据结构化方法预测挑选出的B细胞抗原表位的PyMOL可视化

2.5 CD4⁺T细胞抗原表位的选择

在免疫抗原表位数据库(IEDB)的102个实验验证的抗原表位中，26个是T细胞抗原表位。这些抗原表位缺乏有关与主要组织相容性复合体(majorhistocompatibility complex，MHC)结合的信息，但考虑到于它们的长度(≥15个氨基酸)，我们认为它们是CD4⁺T细胞抗原表位。只有三个是保守的，都来自同一个蛋白质CD2同系物。然而，在与猪及其微生物群中的蛋白质利用BLASTP搜索中，这些蛋白质的一致性都不超过70％，所以放弃了它们。

2.6 预测新的CD4⁺T细胞抗原表位

我们没有在免疫抗原表位数据库(IEDB)中找到符合选择标准的非洲猪瘟病毒CD4⁺T细胞抗原表位，所以我们预测了新的CD4⁺T细胞抗原表位，以确定它们是否可能被纳入疫苗组合(阵容)中。在不变的蛋白质组上应用免疫抗原表位数据库(IEDB)MHCⅡ类结合预测工具，共产生了13342个潜在的15-mer抗原表位，我们继续研究前0.1％结合者中的273个序列；其中大部分是较大肽的15-mer片段。重叠序列的融合产生了74个独特的肽序列。我们放弃了任何被预测为只与一个等位基因结合的抗原表位，因此，我们保留了16个序列。在对野猪及其微生物群中的蛋白质利用BLASTP搜索后，我们从13个不同的蛋白质中选择了14个潜在的抗原表位，这些抗原表位与这些蛋白质的一致性≤70％(表4)。

2.7 CD8⁺T细胞抗原表位的选择

在免疫抗原表位数据库(IEDB)中没有实验验证的CD8⁺T细胞抗原表位，而文献检索也没有发现任何存在于不变蛋白质组中的抗原表位。因此，我们使用模仿这些抗原表位在细胞内自然处理途径的步骤序列预测新的CD8⁺T细胞抗原表位。

蛋白酶体加工不变的蛋白质组生了277个最小长度为9个氨基酸的保守肽，任何短于9个氨基酸的片段都被丢弃。我们从那些大于9个氨基酸长度的蛋白酶体反应衍生的片段中创建了所有可能重叠9-mer的多肽组合，产生了669个潜在的抗原表位。我们采用log(IC₅₀)值为1作为串联亲和纯化法(tandemaffinity purification，TAP)的阈值，将潜在的抗原表位列表限制在40个肽的序列。免疫抗原表位数据库(IEDB)MHCI类结合工具预测了其中33个在前1％内。其中，22个与野猪蛋白的一致性≤70％。然而，考虑到与微生物群中的蛋白质的潜在交叉反应性，我们提高到了≤80％的一致性阈值。选定的潜在CD8⁺T细胞抗原表位的最终清单仅包含来自6个不同蛋白质的6条肽，见表5。

3 讨论

略，详见《国外畜牧学—猪与禽》2022年第3期，北斗农科小程序。

蛋白质互作：串联亲和纯化(TAP-MS)